MLH1は細胞複製時のDNAポリメラーゼによる新生鎖形成において生じる塩基対エラーの修復（ミスマッチ修復）に働く。修復反応は、ミスマッチ部位がMSH2/MSH3またはMSH2/MSH6複合体により認識されところから始まる。続いて、その部位にMLH1/PMS2複合体が結合し、PMS2のエンドヌクレアーゼ活性により新生鎖にニックが入る。そして最後に、EXO1エキソヌクレアーゼが動員され新生鎖の塩基除去が行われた後に、ポリメラーゼδにより複製が行われ完了する。このミスマッチ修復に関わるMLH1, MSH2, MSH6そしてPMS2において機能喪失を引き起こす変異は、ミスペアや単純な繰り返し配列の挿入・欠失を引き起こす。そのため、マイクロサテライト領域 (1から数塩基の塩基配列が繰り返されるDNA配列の領域)においてその影響は顕著となり、繰り返しの数のばらつきが高い頻度で生じるマイクロサテライト不安定性（Microsatellite Instability：MSI）の状態が引き起こされる。ミスマッチ修復異常による変異の蓄積はがん関連遺伝子においても起こるため、腫瘍の発生やその進展の要因となる。ミスマッチ修復関連遺伝子の生殖細胞系列変異は、大腸癌、胃癌、そして子宮内膜癌を若年で発症する常染色体優性遺伝形式の疾患であるLynch症候群との関連が知られている。